Sinh thiết lỏng sử dụng máu - không phải mô khối u - để chẩn đoán ung thư
Thông thường, khối u được kiểm tra bằng cách sử dụng sinh thiết mô. Một mẫu nhỏ được lấy từ khối u và kiểu gen, hoặc phân tích cho trang điểm di truyền. Vấn đề với phương pháp này là các khối u sinh thiết có thể là một thách thức. Hơn nữa, sinh thiết khối u chỉ cung cấp một ảnh chụp nhanh của khối u.
Viết trong khám phá Y học vào năm 2015, Labgaa và đồng tác giả nêu sau đây về sinh thiết khối u thông thường:
Vì lý do rõ ràng, rất khó để theo dõi sự tiến hóa của khối u bằng sinh thiết liên tiếp. Ngoài ra, sinh thiết chỉ phản ánh một điểm duy nhất của khối u và do đó không thể đại diện cho toàn bộ phổ của các đột biến soma trong các khối u lớn. Một lựa chọn khác là lấy nhiều sinh thiết cho cùng một khối u, nhưng lựa chọn này có vẻ không thực tế và không chính xác.
Sinh thiết lỏng liên quan đến việc đo lưu lượng DNA (ctDNA) và các sản phẩm phụ khối u khác trong các mẫu máu thu được từ bệnh nhân ung thư. Phương pháp chẩn đoán mới nổi này hứa hẹn sẽ nhanh chóng, không xâm lấn và tiết kiệm chi phí.
Lịch sử sinh thiết chất lỏng
Năm 1948, Mandel và Métais, một cặp các nhà nghiên cứu người Pháp đầu tiên xác định ctDNA trong máu của những người khỏe mạnh. Phát hiện này đã đi trước thời đại của nó, và nó đã không được cho đến nhiều thập kỷ sau đó ctDNA đã được khám phá thêm.
Năm 1977, Leon và các đồng nghiệp lần đầu tiên xác định số lượng tăng của ctDNA trong máu của bệnh nhân ung thư.
Đến năm 1989, Stroun và các đồng nghiệp đã xác định các đặc điểm ung thư (tức là ung thư) trong máu. Sau những khám phá này, một số nhóm khác đã xác định đột biến cụ thể trong các chất ức chế khối u và oncogenes, sự bất ổn microsatellite, và methyl hóa DNA, chứng minh rằng ctDNA được giải phóng vào lưu thông bởi các khối u.
Mặc dù chúng ta biết rằng ctDNA có nguồn gốc từ các tế bào khối u lưu thông trong máu, nguồn gốc, tỷ lệ giải phóng và cơ chế giải phóng DNA này vẫn chưa rõ ràng, với các nghiên cứu cho kết quả mâu thuẫn. Một số nghiên cứu cho thấy rằng các khối u ác tính hơn chứa các tế bào ung thư chết nhiều hơn và giải phóng thêm ctDNA. Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy rằng tất cả các tế bào giải phóng ctDNA. Tuy nhiên, có vẻ như các khối u ung thư giải phóng các mức tăng của CTDNA vào máu, khiến cho CTDNA trở thành một chất đánh dấu sinh học tốt của bệnh ung thư.
Do sự phân mảnh nặng và nồng độ thấp trong máu, CTDNA khó phân lập và phân tích. Có sự khác biệt về nồng độ CTDNA giữa các mẫu huyết thanh và huyết tương. Có vẻ như huyết thanh hơn là huyết tương là một nguồn tốt hơn của ctDNA. Trong một nghiên cứu của Umetani và cộng sự, nồng độ CTDNA được tìm thấy ở mức thấp nhất trong huyết tương so với huyết thanh do có thể mất DNA tuần hoàn trong quá trình thanh lọc, vì đông máu và các protein khác đang được loại bỏ trong quá trình chuẩn bị mẫu.
Theo Heitzer và các đồng nghiệp, đây là một số vấn đề cụ thể cần được giải quyết để khai thác tiềm năng chẩn đoán của ctDNA:
Đầu tiên, các thủ tục phân tích cần được chuẩn hóa…. Lựa chọn phương pháp phân lập để đảm bảo việc khai thác đủ lượng DNA chất lượng cao là rất quan trọng và nó đã được chứng minh rằng các yếu tố preanalytical của lấy mẫu máu và chế biến có thể ảnh hưởng mạnh mẽ đến năng suất DNA…. Thứ hai, một trong những vấn đề quan trọng nhất là thiếu sự hài hoà hóa các phương pháp định lượng. Các phương pháp định lượng khác nhau, ... tạo ra các kết quả khác nhau bởi vì các phép đo này nhắm đến DNA tổng thể hoặc chỉ có thể khuếch đại được…. Thứ ba, ít được biết về nguồn gốc và cơ chế chi tiết của phát hành ctDNA, và trong hầu hết các nghiên cứu gây nhiễu các sự kiện cũng có thể góp phần giải phóng ctDNA.
Các phương pháp tiếp cận được nhắm mục tiêu và không được nhắm mục tiêu
Hiện nay, có hai phương pháp chính được thực hiện khi phân tích huyết tương (hoặc huyết thanh) cho ctDNA. Cách tiếp cận đầu tiên là nhắm mục tiêu và tìm kiếm những thay đổi di truyền cụ thể biểu thị các khối u. Cách tiếp cận thứ hai là không được nhắm mục tiêu và liên quan đến một phân tích toàn bộ bộ gen tìm kiếm phản ứng của ctDNA đối với ung thư. Ngoài ra, trình tự exome đã được sử dụng như một cách tiếp cận không hiệu quả về chi phí hơn. Exomes là các phần của DNA được sao chép để tạo ra protein.
Với phương pháp tiếp cận được nhắm mục tiêu, huyết thanh được phân tích cho các đột biến di truyền đã biết trong một bộ đột biến trình điều khiển nhỏ.
Các đột biến của trình điều khiển đề cập đến các đột biến trong bộ gen thúc đẩy hoặc “thúc đẩy” sự tăng trưởng của các tế bào ung thư. Những đột biến này bao gồm KRAS hoặc EGFR .
Do những tiến bộ công nghệ trong những năm gần đây, các phương pháp tiếp cận mục tiêu để phân tích bộ gen cho một lượng nhỏ CTDNA đã trở nên khả thi. Những công nghệ này bao gồm ARMS (khuếch đại hệ thống đột biến chịu lửa); kỹ thuật số PCR (dPCR); hạt, nhũ tương, khuếch đại và từ tính (BEAMing); và trình tự sâu (CAPP-Seq).
Mặc dù đã có những tiến bộ trong công nghệ làm cho phương pháp tiếp cận được nhắm mục tiêu có thể, cách tiếp cận nhắm mục tiêu chỉ nhắm vào một vài vị trí đột biến (điểm nóng) và nhớ rất nhiều đột biến trình điều khiển như gen ức chế khối u.
Lợi ích chính của phương pháp tiếp cận không được nhắm mục tiêu đến sinh thiết lỏng là chúng có thể được sử dụng ở tất cả các bệnh nhân do thực tế là xét nghiệm không dựa vào những thay đổi di truyền tái phát. Các thay đổi di truyền tái phát không bao gồm tất cả các bệnh ung thư và không phải là chữ ký ung thư cụ thể. Tuy nhiên, phương pháp này thiếu độ nhạy phân tích và phân tích toàn diện bộ gen của khối u là chưa thể.
Đáng chú ý, giá cả giải trình tự toàn bộ hệ gen đã giảm đáng kể. Năm 2006, giá giải trình tự toàn bộ bộ gen xấp xỉ 300.000 đô la Mỹ. Đến năm 2017, chi phí đã giảm xuống còn khoảng 1.000 đô la (USD) cho mỗi bộ gen, bao gồm cả thuốc thử và khấu hao các máy giải trình tự.
Tiện ích lâm sàng của sinh thiết lỏng
Nỗ lực ban đầu để sử dụng CTDNA là chẩn đoán và so sánh mức độ ở những bệnh nhân khỏe mạnh với những bệnh nhân ung thư hoặc những người bị bệnh lành tính. Kết quả của những nỗ lực này đã được trộn lẫn, chỉ có một số nghiên cứu cho thấy sự khác biệt đáng kể cho thấy ung thư, tình trạng bệnh tật, hoặc tái phát.
Lý do tại sao ctDNA có thể được sử dụng chỉ một số thời gian để chẩn đoán ung thư là bởi vì số lượng biến của ctDNA có nguồn gốc từ các khối u. Không phải tất cả các khối u “đổ” DNA trong cùng một lượng. Nói chung, các khối u tiên tiến hơn, phổ biến hơn làm cho DNA trở nên lưu thông nhiều hơn so với các khối u sớm, cục bộ hóa, cục bộ. Ngoài ra, các loại khối u khác nhau làm giảm lượng ADN khác nhau vào lưu thông. Phần nhỏ của DNA tuần hoàn có nguồn gốc từ khối u có sự thay đổi rộng rãi giữa các nghiên cứu và các loại ung thư, dao động từ 0,01% đến 93%. Điều quan trọng cần lưu ý rằng, nói chung, chỉ một số ít ctDNA có nguồn gốc từ khối u, phần còn lại của nó đến từ các mô bình thường.
DNA tuần hoàn có thể được sử dụng như một dấu hiệu tiên lượng của bệnh. DNA tuần hoàn có thể được sử dụng để theo dõi những thay đổi trong ung thư theo thời gian. Ví dụ, một nghiên cứu cho thấy tỷ lệ sống hai năm ở những bệnh nhân ung thư đại trực tràng (tức là số bệnh nhân còn sống ít nhất hai năm sau khi chẩn đoán ung thư đại trực tràng) và đột biến điểm nóng KRAS là 100% ở những người không có bằng chứng ADN tuần hoàn tương ứng. Hơn nữa, có thể trong tương lai gần, DNA tuần hoàn có thể được sử dụng để theo dõi các tổn thương tiền ung thư.
DNA tuần hoàn cũng có thể được sử dụng để theo dõi đáp ứng với liệu pháp. Bởi vì tuần hoàn DNA proffers một bức tranh tổng thể tốt hơn về các trang điểm di truyền của các khối u, DNA này có khả năng chứa DNA chẩn đoán, có thể được sử dụng thay vì DNA chẩn đoán đạt được từ các khối u.
Bây giờ, chúng ta hãy xem một số ví dụ cụ thể của sinh thiết lỏng.
Guardant360
Guardant Health đã phát triển một thử nghiệm sử dụng trình tự thế hệ tiếp theo để lập hồ sơ lưu hành DNA cho đột biến và sắp xếp lại nhiễm sắc thể cho 73 gen liên quan đến ung thư. Guardant Health xuất bản một nghiên cứu báo cáo các tiện ích sinh thiết lỏng trong ung thư học. Nghiên cứu sử dụng mẫu máu từ 15.000 bệnh nhân với 50 loại khối u kết hợp.
Đối với hầu hết các phần, kết quả từ các xét nghiệm sinh thiết lỏng liên kết với các thay đổi gen quan sát thấy trong sinh thiết khối u.
Theo NIH:
Guardant360 xác định các đột biến quan trọng tương tự trong các gen liên quan đến ung thư quan trọng như EGFR, BRAF, KRAS và PIK3CA ở tần số rất giống với những gì đã được xác định trước đây trong các mẫu sinh thiết khối u, tương quan thống kê với 94% đến 99%.
Hơn nữa, theo NIH các nhà nghiên cứu báo cáo những điều sau đây:
Trong một nghiên cứu thứ hai, các nhà nghiên cứu đã đánh giá gần 400 bệnh nhân, hầu hết đều bị ung thư phổi hoặc ung thư đại trực tràng, cả hai đều có kết quả xét nghiệm DNA và DNA mô máu khối u và so sánh các thay đổi về gen. Độ chính xác tổng thể của sinh thiết lỏng so với kết quả phân tích sinh thiết khối u là 87%. Độ chính xác tăng lên 98% khi mẫu máu và khối u được thu thập trong vòng 6 tháng.
Guardant360 là chính xác mặc dù mức độ lưu hành DNA trong máu thấp. Thông thường, DNA khối u tuần hoàn chỉ chiếm 0,4% DNA trong máu.
Nhìn chung, bằng cách sử dụng sinh thiết lỏng, các nhà nghiên cứu của Guardant đã có thể xác định các dấu hiệu khối u có thể điều trị trực tiếp bởi các bác sĩ ở 67% bệnh nhân. Những bệnh nhân này đủ điều kiện cho các phương pháp điều trị được FDA chấp thuận cũng như các liệu pháp điều tra.
CTDNA và ung thư phổi
Trong năm 2016, FDA đã phê chuẩn Thử nghiệm đột biến EGFR cobas được sử dụng để phát hiện đột biến EGFR trong DNA tuần hoàn của bệnh nhân ung thư phổi. Thử nghiệm này là sinh thiết lỏng được FDA chấp thuận đầu tiên và xác định bệnh nhân có thể là ứng cử viên điều trị với các liệu pháp nhắm mục tiêu sử dụng erlotinib (Tarceva), afatinib (Gilotrif) và gefitinib (Iressa) như điều trị đầu tiên, và osimeritinib (Tagrisso) điều trị bậc hai. Các liệu pháp nhắm mục tiêu này tấn công các tế bào ung thư với đột biến EGFR cụ thể.
Quan trọng hơn, vì số lượng lớn các kết quả âm tính giả, FDA khuyến cáo rằng một mẫu sinh thiết mô cũng được lấy từ một bệnh nhân có sinh thiết lỏng âm tính.
CTDNA và ung thư gan
Số người chết vì ung thư gan đã tăng lên trong 20 năm qua. Hiện nay, ung thư gan là nguyên nhân thứ hai gây tử vong do ung thư trên thế giới. Không có các dấu ấn sinh học tốt để phát hiện và phân tích gan, hoặc tế bào gan (HCC), ung thư. DNA tuần hoàn có thể là một dấu ấn sinh học tốt cho bệnh ung thư gan.
Xem xét báo giá sau đây từ Lagbaa và các đồng tác giả về tiềm năng sử dụng DNA tuần hoàn để chẩn đoán ung thư gan:
Hypermethylation của RASSF1A, p15, và p16 đã được đề xuất là công cụ chẩn đoán sớm trong một nghiên cứu hồi cứu bao gồm 50 bệnh nhân HCC. Một chữ ký của bốn gen methylated aberrantly (APC, GSTP1, RASSF1A, và SFRP1) cũng đã được kiểm tra độ chính xác chẩn đoán, trong khi methylation của RASSF1A đã được báo cáo như là một dấu ấn sinh học tiên lượng. Các nghiên cứu sau đó đã phân tích CTDNA ở bệnh nhân HCC sử dụng công nghệ phân tích sâu .... Nổi bật, số lượng DNA sao chép bất thường được phát hiện ở hai người mang HBV mà không có tiền sử HCC trước đó, nhưng đã phát triển HCC trong thời gian theo dõi. Phát hiện này đã mở ra cánh cửa để đánh giá sự thay đổi số bản sao trong ctDNA như một công cụ sàng lọc để phát hiện sớm HCC.
Một từ từ
Sinh thiết dạng lỏng là một cách tiếp cận mới thú vị để chẩn đoán hệ gen. Hiện nay, một số sinh thiết lỏng, cung cấp hồ sơ phân tử toàn diện, có sẵn cho các bác sĩ để bổ sung thông tin di truyền thu được từ sinh thiết mô. Cũng có một số sinh thiết lỏng có thể được sử dụng thay cho sinh thiết mô - khi không có sinh thiết mô.
Điều quan trọng cần lưu ý là nhiều thử nghiệm sinh thiết lỏng hiện đang được tiến hành và cần phải nghiên cứu thêm để xác định khả năng điều trị của can thiệp này.
> Nguồn:
> Xét nghiệm máu cho những thay đổi di truyền trong khối u cho thấy sự hứa hẹn như là thay thế cho khối u sinh thiết. NIH.
> Heitzer E, Ulz P, Geigl JB. DNA khối u tuần hoàn như một sinh thiết lỏng cho ung thư. Hóa học lâm sàng. 2015; 61: 112–123. doi: 10.1373 / clinchem.2014.222679
> Lagbaa J, Villanueva A. Sinh thiết chất lỏng trong ung thư gan. Khám phá Y học. 2015, 19 (105): 263-73.
> Sinh thiết bằng chất lỏng: Sử dụng DNA trong máu để phát hiện, theo dõi và điều trị ung thư. NIH.
> Umetani N, et al. Lượng ADN tuần hoàn tự do trong huyết thanh cao hơn so với trong huyết tương không phải chủ yếu do DNA không liên quan bị ô nhiễm trong quá trình tách. Ann NY Acad Sci. 2006, 1075: 299-307.
> Wellstein A. Nguyên tắc chung trong dược lý ung thư. Trong: Brunton LL, Hilal-Dandan R, Knollmann BC. eds. Goodman & Gilman's: Cơ sở dược lý của Therapeutics, 13e New York, NY: McGraw-Hill.